AAV主要生产平台概述
本文节选自《Overview of major AAV production platforms》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
基因治疗有望治愈目前传统医学无法解决的遗传性疾病，包括许多罕见疾病。在基因治疗产品的中心是为临床前和临床开发铺平道路的病毒载体。其中最广泛使用的病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体，它已被广泛用于将有效载荷递送到目标组织。针对特定组织的高疗效AAV载体的构建已经取得了显著进展。为此，AAV载体已被用于大量的临床试验和商业化基因治疗产品。另一方面，基于AAV的基因治疗产品非常昂贵，主要原因是AAV载体的生产和纯化的复杂性。
目前广泛采用的AAV载体生产方案是三质粒瞬时转染。在三质粒转染生产方法中，HEK293细胞以质粒共转染，包括含有AAV cis结构的质粒，其携带两侧为ITR的转基因表达盒，一个包含Rep和Cap表达盒的质粒，以及一个携带腺病毒辅助基因 (E2a/b、E4和VARNA基因)的质粒。HEK293产生细胞整合了腺病毒E1A和E1B基因的拷贝。一般来说，粗裂解液在转染后72小时收获，然后进行后续纯化。三质粒瞬时转染方法比其它方法相对更有优势，因为它可以灵活且快速地建立用于早期临床开发。为此，直接的转染方案、开发质粒的低成本、以及生产不同血清型的方法的敏捷性是这种技术的优点。然而，与用于AAV生产的稳定生产细胞系方法相比，这种方法仍然存在可放大性和成本效益方面的问题。AAV生产的主要挑战之一是较低的完整/空病毒颗粒比例，其范围可能低于30%。有研究认为Rep和Cap表达的时间不协调性可能是导致低病毒产率的原因之一。为了规避这一问题，目前正在努力通过操纵其启动子、开发Rep和Cap的分离系统或通过优化质粒的转染比例来优化Rep和Cap的表达。
稳定细胞系是产生AAV的另一种替代三质粒瞬时转染的方法。通常，稳定包装细胞系会将Rep和Cap的拷贝整合到它们的基因组中。此外，生产细胞系可能包含其它成分，如携带目的转基因的AAV cis结构和其它腺病毒辅助基因。根据工程细胞系设计，可以通过转染cis载体结构并用腺病毒感染来获得辅助功能，或者，cis结构和辅助功能可以分别通过AAV-腺病毒杂交和腺病毒共感染来提供，从而实现AAV生产。迄今为止，大多数这样的包装细胞系基于HeLa细胞。然而，使用肿瘤细胞系(如HeLa细胞)用于AAV的商业化生产存在安全问题。由于Rep表达的毒性，开发基于HEK293的稳定Rep和Cap表达细胞系仍然是一个挑战。与三质粒瞬时转染方法相比，基于稳定细胞系的AAV生产在生产可放大性方面具有显著的优势。然而，开发这样的细胞系对于所需的载体-血清型组合来说并不是一项容易的任务。在长时间的传代过程中，生产和包装细胞系的稳定性和相关的生产滴度必须被很好地表征，这使得开发一个稳定的生产细胞系的工作变得非常繁琐。
基于杆状病毒的AAV生产方法是基于哺乳动物细胞的AAV生产方案的另一种替代方案。该方法利用杆状病毒表达载体，通过Spodoptera frugiperda昆虫细胞(Sf9)共感染，递送Rep/Cap基因和AAVcis结构，后者携带目的转基因。作为共感染方案的一种变体，使用携带所有成分的重组杆状病毒载体单次感染Sf9细胞，使基于杆状病毒的系统更加通用和灵活。此外，基于杆状病毒的系统在可放大性和成本效益方面相比三质粒瞬时转染方法更有优势。而且，基于杆状病毒的系统已被证明可以生产高滴度的AAV，而污染性DNA的衣壳化可尽可能地被降低，这反过来使其成为大规模AAV生产的一个良好替代方案。然而，在昆虫细胞中产生的AAV颗粒的翻译后修饰影响还有待进一步研究。
目前基于AAV的病毒载体生产方法无法满足大规模临床试验和商业化应用的需求。因此，迫切需要开发创新的AAV生产方案，将基因治疗的希望变为现实。
原文：J.Bulcha, Overview of major AAV production platforms. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(9),1073–1076.
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