从浙江选考命题角度解读“原生质体”的疑难问题

严灵剑（浙江省象山中学 象山 315700）

摘 要本文从原生质体的获取、纯化、培养、分裂和活性鉴定五个方面，深入解读了近几年浙江选考题中涉及原生质体的疑难问题。

关键词浙科版 原生质体 教学疑难

原生质体研究的热潮开始于20世纪80年代早期，并在随后的几年中对原生质体的研究逐步深入，目前包括园艺植物在内的近400种植物已成功实现原生质体的分离。在浙江省的选考试题中也经常原生质体，主要涉及获取、纯化、培养、分裂和活性鉴定等五个方面，下面笔者就相关内容和大家交流一下。

1 原生质体是否一定要用纤维素酶和果胶酶来获取？

原生质体分离常用的酶有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。一般来说，分离叶肉细胞和悬浮细胞的原生质体时只需纤维素酶和果胶酶即可。纤维素酶消化细胞壁的纤维素，果胶酶主要用于分解胞间层中的果胶，促使细胞的分离。分离愈伤组织原生质体时，加上半纤维酶来降解细胞壁中的半纤维素，效果会更好，酶的用量和酶解时间需适当增加。[1]由此可见，原生质体的取材来源，直接决定了所需酶的种类。

【选考真题】（2016年浙江选考T32）（节选）（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的纤维素酶和果胶酶的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。

【分析】这题是从叶片进行处理来获得原生质体，类似于从叶肉细胞中分离原生质体，所以要加纤维素酶和果胶酶。

2 原生质体为什么要纯化及如何纯化？

细胞酶解后的混合物中，除完整未损伤的原生质体外，还含有许多杂质，如细胞碎片、叶绿体、维管束成分、未被消化的细胞组织和破裂的原生质体。因而必须把这些杂质除掉。清除较大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿过一个50~70mm的镍丝网进行过滤。然后再利用密度，通过多次离心，取某一界面物或是除去上清液，进一步纯化。最后获得纯净的原生质体。[2]由此可见，酶解后的混合物经过过滤、离心等纯化步骤后，才能获得我们想要的原生质体。

【选考真题】（2016年浙江选考T32）（节选）（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的纤维素酶和果胶酶的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。

【分析】在获取原生质体的过程中会混有杂质，可以通过过滤初步纯化，再通过离心进一步纯化。

3 原生质体培养过程中何时降低渗透压？

在原生质体还没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，它必须有培养基渗透压的保护。培养基中的渗透压一般是用0.5~0.6mol/L甘露醇或山梨醇调节的。培养开始后7~10d,大部分有活力的原生质体已经再生出细胞壁并进行了几次分裂，此后通过定期加入几滴不含渗压剂或渗压剂水平很低的新鲜培养基，可使培养基的渗透压逐渐下降（若还把渗压剂保持在原来的高水平上，若干时间以后细胞就会停止分裂）。最后将肉眼可见的细胞团转入到不含渗压剂的新鲜培养基中。[3]由此可见，原生质体培养基中的渗透压应该在细胞分裂几次后，用渗透压相对较低的渗压剂来降低培养基中的渗透压，直至用不含渗压剂的新鲜培养基来培养细胞团。

【选考真题】（2016年浙江选考T32）（节选）（2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该降低 培养基中的甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。

【分析】如果保持获得原生质体时的渗透压将会阻止细胞的分裂，从而无法获得细胞团。

4 原生质体何时进行细胞分裂？

原生质体混合物中，一旦把酶洗掉，原生质体立即开始合成新壁。一般来说，来源于已分化的初始材料，其原生质体相比于未分化材料的原生质体合成细胞壁的能力要弱。细胞壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂。凡能继续分裂的细胞，经2~3周培养后可长出细胞团。[4]由此可见，原生质体只有在再生细胞壁后，才能进行细胞分裂。

【选考真题】（2020年1月浙江选考T29）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁 后，才可进行有丝分裂。

【分析】细胞壁的形成直接影响了原生质体的分裂。不能再生细胞壁的原生质体将难以进行分裂。

5 原生质体的活性如何鉴定？

原生质体活动检测方法有形态观察法、二乙酸荧光素法、酚藏花红染色法、伊文斯蓝染色法。①形态观察法。主要观察原生质体形态及胞内环流。有活力的原生质体形态规则完整，颜色鲜艳，胞内环流明显；无活力原生质体胞内浑浊，无色泽且透光，胞内环流不显著。②酚藏花红染色法。其原理是活性原生质体染色后在荧光显微镜下可观察到红色；而无活性原生质体无色。③伊文斯蓝染色法。其原理就是死细胞或受损细胞可吸收伊文斯蓝，而完整活细胞不吸收或积累该物质，④二乙酸荧光素法。该方法的原理是FDA自由穿越细胞膜，并积累在活细胞中，被活细胞酯酶酶解产生荧光素。在荧光显微镜下可以观察荧光产生。而荧光素无法在死细胞中积累。因此，无活力的原生质体无荧光产生。[5]由此可见，原生质体的活性可以通过形态观察，着色等方法进行鉴定。

【选考真题】（2020年1月浙江选考T29）(1)为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有染色法，渗透吸水失水 (答出2点即可)。

【分析】该题中提到的染色法，可以是酚藏花红染色法或伊文斯蓝染色法，也可以参考浙科版教材中“验证活细胞吸收物质的选择性”活动中的红墨水染色法。还可以用形态观察法，如观察胞质环流的情况。该题中提到的渗透吸水失水，是参考浙科版教材中“观察洋葱表皮细胞的质壁分离及质壁分离复原”活动，能发生渗透吸水失水的是活细胞。

参考文献

1.陈劲枫.植物组织培养与生物技术[M].北京：科学出版社，2018:131

2.陈劲枫.植物组织培养与生物技术[M].北京：科学出版社，2018:133

3.李浚明 朱登云.植物组织培养教程（第3版）[M]北京：中国农业大学出版社，2005：189

4.李浚明 朱登云.植物组织培养教程[M]北京：中国农业大学出版社，2005：194-195

5.陈劲枫.植物组织培养与生物技术[M].北京：科学出版社，2018:134