脑卒中是脑组织损伤的破坏性脑血管疾病，可引发身体残疾和多重功能损伤，是全球第二大死因，其中80%以上为缺血性脑卒中。

缺血性脑卒中持续时间越久，脑损伤越严重，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特点，加强对缺血性脑卒中的研究具有积极的现实意义。

补阳还五汤出自《医林改错》，由黄芪、赤芍、川芎、当归尾、地龙、桃仁、红花7味中药组成，具有补气、活血、通络的功效，是治疗缺血性脑卒中的经典名方。

补阳还五汤治疗缺血性脑卒中的疗效确切，但其药效物质基础尚不够明确，常需要结合血浆、尿液、脑组织中的药物化学成分进行药效物质基础研究，其在作用部位的成分及其浓度常与疗效成正相关。

补阳还五汤作用于机体后，有效成分以血液为桥梁向病变部位转移，形成了治疗缺血性脑卒中的药效物质基础。

寻找和分析补阳还五汤入血、入脑成分，可为阐明其药效物质基础提供依据。

故本研究拟采用线栓法复制缺血性脑卒中大鼠模型，采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）法检测补阳还五汤干预后的大鼠血清及脑组织，确认其入血、入脑成分，以阐明其治疗缺血性脑卒中的药效物质基础，为其作用机制研究提供科学依据。

雄性SD大鼠20只，SPF级，体质量（280±20)g，由珠海百试通生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2020-0051，动物质量合格证号：44822700002308。

动物使用许可证号：SYXK（粤）2020-0051，大鼠饲养在广州中医药大学实验动物中心，温度25℃，湿度30%～60%，明暗周期各12h，自由饮水、摄食。

适应性饲养1周后开始实验，实验前禁食不禁水12h。

本研究涉及的动物实验经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理批号：20210323002。

补阳还五汤组方中药：黄芪（批号：220302701）、当归尾（批号：220101951）、赤芍（批号：211100191）、川芎（批号：190800201）、红花（批号：191203821）、桃仁（批号：220401801）、地龙（批号：210701931），上述中药材均购于康美大药房连锁有限公司，经广州中医药大学张英丰副教授鉴定为正品。

乙腈（批号：JA095630），美国Merck公司；甲醇（批号：21110224G102），美国Oceanpak公司；甲酸（批号：20170103），天津市大茂化学试剂厂；红四氮唑（RT，批号：C13066604），上海麦克林生化科技有限公司；注射用青霉素钠（批号：20200301），天津市保灵动物保健品有限公司；异氟烷（批号：045740），北京友诚嘉业生物科技有限公司；戊巴比妥钠（批号：20130307），天津天力化学试剂有限公司。

LC-30AD型超高效液相色谱仪（含SIL-30AC型自动进样器、CTO-20AC型柱温箱），日本岛津公司；ABSCEIXTripleTOFTM5600+飞行时间质谱仪（含PeakView、MarkerView、AnalystTF1.7软件），美国ABSCEIX公司；ZORBAXSB-AqC18色谱柱（2.1mm×100mm，3.5μm），美国Agilent公司；LGJ-12型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；E3116R型台式高速低温离心机，美国Essenscien公司。

根据补阳还五汤处方比例称取黄芪120g、当归尾6g、赤芍5g、川芎3g、红花3g、桃仁3g、地龙3g；粉碎后加入5倍量纯水，加热回流提取2h，用纱网过滤，滤液以4℃、5000×g离心10min后，取上清液；倒入冻干盘中，液面高度约为1cm，于-80℃冰箱中预冻过夜；然后在真空冷冻干燥机中冻干约48h，即得补阳还五汤冻干粉，快速称质量后置于干燥器中保存，每克冻干粉相当于生药3.21g。

取补阳还五汤冻干粉0.2g，置于1mL容量瓶中，甲醇定容，超声20min，得0.2g·mL-1样品溶液（约相当于生药0.642g·mL-1）；于-20℃静置数小时后，以4℃、10000×g离心10min，取上清液，进样前以0.22μm微孔滤膜滤过，置于内插管中进样。

(1）将20只SD大鼠按照体质量随机分为模型组和给药组，采用线栓法复制大脑中动脉阻塞（MCAO）大鼠模型：大鼠颈部正中作一切口，逐层分离皮肤、肌肉组织，充分暴露颈总动脉；逐级分离，使颈内动脉和颈外动脉充分暴露。

分别结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，用微动脉夹夹闭颈内动脉。

于颈总动脉结扎处和分叉口之间用眼科剪剪一“V”字型切口，以合适角度插入线栓；松开颈内动脉的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内；插入Willis环，当感到略有阻力时停止，此时线栓头离分叉口为（17±1)mm，确定无活动性出血后进行缝合。

手术过程中维持动物体温恒定，术后注射抗生素抗感染。

1. 模型组大鼠按照10mL·kg-1灌胃蒸馏水，给药组按照生药5.4g·kg-1剂量（相当于临床等效剂量的7.2倍）灌胃补阳还五汤冻干粉药液，每日1次，连续给药7d。

（3）末次给药后，随机从模型组及给药组中各抽取2只大鼠，以2%异氟烷吸入麻醉；立即处死并迅速取出大鼠脑组织，于-20℃冷冻30min后，将脑组织以冠状位切面横切成5片，每片厚2mm；脑片置于2%TTC溶液中，37℃下孵育30min染色后，用4%多聚甲醛溶液固定24h；脑片固定后进行拍照，切片中红色区域为正常脑组织区域，白色为梗死区域。

结果表明，补阳还五汤对缺血性脑卒中大鼠具有改善作用。

（4）末次给药结束1h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，冰上分离脑组织；血样在4℃下静置数小时后，以4℃、3000×g离心10min，取血清，-80℃冻存备用。

(1）血清样品处理：精密吸取大鼠血清300μL，加入3倍体积乙腈（4℃），涡旋1min；以4℃、10000×g离心10min，吸取上清液至5mL玻璃刻度离心管，40℃下氮气挥干；100μL乙腈（4℃）复溶，涡旋1min，超声1min后转移至1.5mLEP管中；-20℃冷冻数小时后，以4℃、10000×g离心10min，吸取上清液至内插管中进样分析。

（2）脑组织样品处理：精密称定大鼠脑组织质量，按照质量体积比为1∶1(g·L-1）加入4℃生理盐水；置于低温组织研磨器中，以60Hz、3个循环研磨1min；吸取脑组织匀浆液300μL，加入3倍体积乙腈（4℃），以4℃、10000×g离心10min；吸取上清液至5mL玻璃刻度离心管，40℃氮气挥干；100μL乙腈复溶，涡旋1min，超声1min后转移至1.5mLEP管中；-20℃冷冻数小时后，以4℃、10000×g离心10min，吸取上清液进样分析。

AgilentZORBAXSB-AqC18色谱柱（2.1mm×100mm，3.5μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～5min，90%～65%A;5～10min，65%～35%A;10～13min，35%～15%A;13～15min，15%～0%A;15～17min，0%A;17～18min，0%～90%A;18～21min，90%～90%A）；流速：0.3mL·min-1；柱温：30℃；样品室温度：4℃。

正离子模式下进样10μL，负离子模式进样20μL。

采用电喷雾离子源正、负离子扫描模式；正、负离子源电压分别为5500V、-4500V；离子源温度500℃；去簇电压为±100V；离子源雾化气和辅助气压力均为55Pa；气帘气压力为35Pa。

一级质谱扫描范围为m/z100～2000Da；碰撞能为45eV。

二级质谱采用highsensitivity模式，扫描范围为m/z50～2000Da；开启动态背景扣除（DBS）；采用AnalystTF1.7软件进行数据采集。